qPCR og RT-PCR

Bioteknologi A · STX · A-niveau · Genteknologi

🧫 qPCR og RT-PCR

qPCR (quantitative PCR / real-time PCR) + RT-PCR (reverse-transcription PCR) = avancerede PCR-teknikker.

Standard PCR (Kary Mullis 1983, Nobel 1993): kopierer DNA eksponentielt. 30-40 cykler → 10⁹-10¹² kopier. qPCR (real-time PCR): måler DNA-mængden UNDERVEJS i hver cyklus via fluorescerende sondes (fx SYBR Green, TaqMan-prober).

Hovedfordel: KVANTITATIV — kan bestemme HVOR MEGET startmateriale der var.

Cycle threshold (Ct): cyklus hvor fluorescens passerer threshold. Lav Ct = højt startmateriale. Hver Ct-værdi = 2x forskel.

Anvendelser qPCR:

1.

COVID-19-test — RT-qPCR var guld-standard 2020-22. SARS-CoV-2 har RNA-genom → først reverse transcription, så qPCR.

2.

Genekspression-måling: hvor meget mRNA produceres af et givet gen i celle.

3. GMO-detektion i fødevarer.

4.

Forensik: kvantitativ DNA-mængde fra spor.

5.

Klinisk diagnostik: HIV viral load, hepatitis C-monitorering.

RT-PCR: omsætter RNA → cDNA via revers transkriptase (enzym fra retrovirus). Derefter kan cDNA amplificeres med almindelig PCR.

Anvendelser RT-PCR:

1.

Gen-ekspression — er et gen aktivt? RNA tilstede?

2.

Virus-diagnostik — RNA-vira (SARS-CoV-2, influenza, HIV, hepatitis C) skal first reverses transcribes.

3.

Splice-variant-analyse: hvilken mRNA-version produceres?

Praktisk procedure: (1) Isolér RNA fra prøve. (2) RT (reverse transcription) → cDNA. (3) qPCR med specifikke primere. (4) Analysér Ct + smelt-kurver. Tidskrav: typisk 1-3 timer fra prøve til resultat — markant hurtigere end traditionel virusdyrkning.

Læringsmål

• Forklare PCR (polymerase chain reaction) trinvist
• Anvende gel-elektroforese og restriktionsenzymer
• Forklare CRISPR-Cas9 og guide-RNA
• Forklare plasmid-vektorer og kloning
• Diskutere etiske aspekter af gen-redigering og GMO

Sådan kan du arbejde med emnet

• Forklar, hvad qPCR kan, som almindelig PCR ikke kan
• Beskriv, hvordan RT-PCR bruges til at undersøge genekspression ved at omdanne RNA til cDNA
• Diskutér, hvorfor qPCR har været et vigtigt redskab til at teste for virusinfektioner

Eksperiment-forslag

• Tegn en Ct-kurve (fluorescens vs. cyklusnummer) for to prøver med forskellig startkoncentration, og forklar hvorfor lav Ct svarer til høj startmængde.
• Forklar trin for trin, hvordan en RNA-virus (fx SARS-CoV-2) detekteres med RT-qPCR — fra prøvetagning til resultat.
• Diskutér hvorfor qPCR er bedre end almindelig PCR til at måle genekspression kvantitativt.

Brobygning

Når man har amplificeret og kvantificeret DNA, kan man gå skridtet videre og bestemme den fulde basesekvens — næste emne er 'DNA-sekventering (Sanger, NGS)'.