DNA-sekventering (Sanger, NGS)

Bioteknologi A · STX · A-niveau · Genteknologi

🧫 DNA-sekventering (Sanger, NGS)

DNA-sekventering = bestemmelse af BASE-RÆKKEFØLGEN (A, T, C, G) i et DNA-fragment. Centralt værktøj i moderne molekylærbiologi + medicin.

2 hovedteknologier:

1.

Sanger-sekventering (kæde-termination, Frederick Sanger 1977): klassisk, præcis, langsom.

Princip: DNA-polymerase-reaktion med BÅDE almindelige nukleotider (dNTPs) + dideoxy-nukleotider (ddNTPs) i lille koncentration. ddNTPs HAR INGEN 3'-OH → polymerase STOPPER når en ddNTP indsættes. Resultat: blanding af DNA-fragmenter af alle længder, hver endet med en ddNTP. Hver ddNTP fluorescensmærkes i forskellig farve (A=grøn, T=rød, C=blå, G=sort). Fragmenterne separeres efter LÆNGDE via kapillær-elektroforese. Detektor læser fluorescens → giver basesekvensen.

Karakteristika:

• (a) Læser ~500-1.000 baser per reaktion.
• (b) Ekstremt nøjagtig (>99,99%).
• (c) Tager 1-3 timer.
• (d) Pris: ~$10/sekvensering nu.
• (e) Bruges til: enkelt-gen-analyse, kontrol af PCR-produkter, sjældne sygdomme (CFTR, BRCA1/2). Human Genome Project (1990-2003) brugte automatiseret Sanger — kostede $3 mia. + tog 13 år!

2.

Next Generation Sequencing (NGS, "deep sequencing"): revolution fra ~2005.

Princip: parallel sekventering af MILLIONER af DNA-fragmenter SAMTIDIG.

Hovedplatformer: (a) Illumina — markedsledende. Sekventering ved syntese (SBS) — DNA fragmenteres → bindes til flowcell → klusterdannelse via brokebrigde-amplifikation → sekventering ved fluorescens-mærkede nukleotider. Læser 50-300 baser per fragment, men millioner af fragmenter SAMTIDIG — derfor kan et helt menneske-genom sekventeres på under et døgn for under $1.000, mod $3 mia. og 13 år for Human Genome Project.

Læringsmål

• Forklare PCR (polymerase chain reaction) trinvist
• Anvende gel-elektroforese og restriktionsenzymer
• Forklare CRISPR-Cas9 og guide-RNA
• Forklare plasmid-vektorer og kloning
• Diskutere etiske aspekter af gen-redigering og GMO

Sådan kan du arbejde med emnet

• Forklar princippet bag Sanger-sekventering med fluorescensmærkede baser
• Beskriv, hvordan Next Generation Sequencing (NGS) adskiller sig fra Sanger-sekventering med hensyn til hastighed og mængde
• Diskutér, hvilke fordele NGS giver i forhold til at sekventere et helt genom

Eksperiment-forslag

• Sammenlign Sanger-sekventering og NGS i en tabel: hastighed, pris, nøjagtighed, datamængde og typiske anvendelser.
• Forklar hvorfor ddNTPs (uden 3\'-OH) er nøglen til Sanger-sekventering — tegn en kæde-termination-reaktion.
• Beregn omkostningsudviklingen i DNA-sekventering fra Human Genome Project ($3 mia.) til i dag (~$1.000) som faktor, og diskutér hvad det betyder for personlig medicin.

Brobygning

Når man kender et genoms sekvens, kan man designe vektorer til at indsætte eller ændre specifikke gener — næste emne er 'Plasmid-vektorer og kloning'.